For det første efterlader både EcoR1 og Xba1 5' udhæng, når de fordøjer DNA (ligesom Nde1). I begge tilfælde er 3'-enden forsænket, hvorfor polyermase kan tilføje baser. For det andet kan alle polymeraser kun tilføje baser til en 3'-ende, så Klenow tilføjer 4 baser til den tilbagetrukne 3'-ende af begge steder for at generere stumpe ender.
Forlader restriktionsenzymer en 5-fosfat?
Vektorer og inserts fordøjet af restriktionsenzymer indeholder de nødvendige terminale modifikationer (5'-phosphat og 3'-hydroxyl), mens fragmenter skabt af polymerasekædereaktionen (PCR) muligvis ikke.
Kan stumpe ender ligeres?
Blunt-end ligering
Blunt end ligering involverer ikke baseparring af de udragende ender, så enhver stump ende kan ligeres til en anden stump ende. Stumpe ender kan genereres af restriktionsenzymer såsom Smal og EcoRV.
Producerer Taq-polymerase stumpe ender?
Yes… Taq Polymerase tilføjer A-Overhangs, hvis du holder det sidste forlængelsestrin ved 72 dC på PCR. Mest brugt til TA-kloning.
Hvorfor bruge Klenow-fragment i DNA-sekventering?
Klenow-fragmentet er ekstremt nyttigt til forskningsbaserede opgaver såsom: Syntese af dobbeltstrenget DNA fra enkeltstrengede skabeloner . Udfyldning af tilbagetrukne 3'-ender af DNA-fragmenter for at gøre 5'-udhæng stump . Fordøjelse af udragende 3' udhæng.
